ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BẮT AFLATOXIN G1 CỦA CỘT SẮC KÍ ÁI LỰC MIỄN DỊCH DO VIỆN PASTEUR TP. HCM SẢN XUẤT (Đề cương Aflatoxin)

11 Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14] Loaị thực phẩm Sữa nước Sữa bột Sữa nước Sữa bột Dầu ăn và các chất béo Thực phẩm Thực phẩm Đối tượng sử dụng Trẻ em < 3 tuổi Trẻ em < 3 tuổi Thông dụng Thông dụng Trẻ em và thiếu niên Các loaị Giới hạn (ppb) 0,03 0,3 0,05 0,5 5 1 10 Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm ban hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT. Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam STT 1 2 3 Tên độc tố vi nấm Aflatoxin tổng số hoặc B1 Aflatoxin M1 Các độc tố vi nấm khác Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối Thức ăn Sữa Thức ăn đa cho phép (ppm) 10 0.5 35 Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm. Loại vật nuôi AFB1 (ppb) AFT tổng (ppb) ≤ 20 ≤ 30 Gà con từ 1-28 ngày tuổi ≤ 30 ≤ 50 Nhóm gà còn lại ≤ 10 Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Không có ≤ 10 ≤ 20 Nhóm vịt còn lại ≤ 10 ≤ 30 Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tuổi ≤ 100 ≤200 Nhóm lợn còn lại ≤ 20 ≤ 50 Bò nuôi lấy sữa (Ban hành theo quyết định số 104/2001 QD-BNN của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn ngày 31-10-2001). 2.2 Các phương pháp phân tích aflatoxin 2.2.1 Phương pháp sinh vật học Phương pháp này đã được sử dụng đầu tiên, chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm của một số loài sinh vật được thử nghiệm với aflatoxin. Đây là phương pháp định tính hay bán định lượng, không chuyên biệt đối với từng độc tố nhưng đơn giản và dễ thực hiện. 12 Thử nghiệm độc tính trên phôi gà (Chicken Embryo Bioassay): Chiết mẫu bằng chloroform cô đặc có nồng độ khoảng 200-300 ng/ml, sau đó tiêm vào buồng khí hoặc lòng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tính và ấp trong 5 ngày, phôi gà sẽ chết trong vòng 2 ngày nếu có aflatoxin. Thử nghiệm này đã được đưa vào tiêu chuẩn AOAC [10]. Ngoài ra, độc tính của aflatoxin còn được thử nghiệm trên vịt con mới sinh, ấu trùng của loài giáp xác, tế bào động thực vật nuôi cấy, trên vi khuẩn Bacillus megaterium, trên cá hồi…[10] 2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lí Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính xác và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm. Các giai đoạn cơ bản: Lấy mẫu Chiết aflatoxin Tinh chế aflatoxin Cô đặc mẫu Phát hiện và định lượng aflatoxin 2.2.2.1 Lấy mẫu Mục đích: Lấy mẫu đại diện cho lô hàng hay đối tượng khảo sát. Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu. 2.2.2.2 Chiết aflatoxin 13 Mục đích: Tách aflatoxin cần tìm từ khối mẫu gồm nhiều chất phức tạp. Sự lựa chọn dung môi cho việc chiết mẫu tuỳ thuộc vào tính chất hóa học của aflatoxin cũng như tính chất của các thành phần khác. Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết aflatoxin. Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform, hay methanol. Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môi với một lượng nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất. Trong khi độ hoà tan của aflatoxin trong nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho sự chiết tách hữu hiệu hơn. Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút. Một số phương pháp chiết: • Chiết bằng dung môi chloroform-Phương pháp EEC (European Economic Community) • Chiết bằng dung môi methanol - Phương pháp BF (Best Food) - Phương pháp VICAM 2.2.2.3 Làm sạch mẫu Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng aflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũng như việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột. Các kĩ thuật làm sạch  Tủa các tạp chất không mong muốn: thường dùng để làm sạch các dịch chiết có nguồn gốc thực vật. Các hoạt chất dùng là các muối kim loại nặng, ví dụ Pb(CH3 COO)2, AgNO3, Zn(CH3 COO)2, CuCO3… 14  Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform).  Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các aflatoxin ở hàm lượng thấp. Thể tích đưa vào cột rất ít (1-3ml), khả năng loại tạp rất cao, thích hợp cho phân tích bằng HPLC [12]. Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất không phân cực như: C 18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ chế kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trong nhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14]. 2.2.2.4 Cô đặc mẫu Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Cặn được hòa tan vào một lượng thể tích nhỏ trước khi qua giai đọan xác định. 2.2.2.5 Phát hiện và xác định hàm lượng Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc kí. Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng. Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin. Phương pháp sắc Nguyên tắc Ưu điểm Nhược điểm 15 (Minicolumn) Sắc kí cột nhỏ kí Cột thủy tinh hay PE có Ø= 5-6 mm, dài khoảng 20 cm được nhồi các lớp chất có tính hấp phụ độc tố: alumina, silicagel và florisil. Calcium sunphate có tính giữ nước được nhồi ở hai phía đầu. Cho mẫu chiết vào cột, chảy qua cột nhờ trọng lực. Lớp chất hấp phụ - tốn ít thời gian: - là phương pháp bán 15-30 phút. định lượng nhanh nhằm - không cần thiết bị phức tạp, đắt tiền. - có thể dùng tiện lợi trên đánh giá sơ bộ. - kém nhạy, mức phát hiện khá cao: 20 ppb. hiện - Không phân biệt các trường AFT khác nhau. - thích hợp ở các sẽ giữ AFT lại và ta phát hiện được nước khi cho cột chiếu dưới đèn UV λ= đang phát triển 365 nm, có vết huỳnh quang màu xanh tím ở lớp florisil. So sánh với một cột chuẩn chứa lượng AFT đã (TLC) Sắc kí lớp mỏng biết, ta có thể đánh giá mẫu chứa AFT ít hay nhiều hơn so với chuẩn. Pha tĩnh là một lớp mỏng chất có tính hấp phụ, thường là silicagel, - tương đối đơn giản được phết lên một bản mỏng (nhôm - thường sử dụng hoặc nhựa). Pha động là dung môi chứa chất - mang tính bán định lượng. nhất ở các nước - kết quả phụ thuộc vào đang phát triển và người phân tích. trong các phòng - độ chính xác không cao mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản. (TLC cần khảo sát được cho chạy qua lớp thí nghiệm. Dịch chiết được chấm lên bản mỏng thành các đốm với thể tích thường là 2, 5, 10 µl; đốm chuẩn cũng được nhỏ lên cùng bản mỏng. Sau đó, - khá rẻ tiền so với HPLC. - Độ nhạy khá cao: 0,5-5 ppb. do lệ thuộc vào mắt người đọc. Densitometer cho độ chính nhưng xác cao không hơn thông bản mỏng được cho vào dung môi - kĩ thuật TLC 2 khai triển để các đơn chất trong hỗn chiều cho kết quả hợp có thể tách rời nhau khi di rất tốt và mức phát - sai số khoảng 30%. chuyển bằng lực mao quản. hiện cũng thấp, có Việc phát hiện và định lượng tiến hành dưới tia UV có λ= 365nm. Dùng dụng cho các phòng thí nghiệm địa phương. thể so sánh với HPLC. máy densitometer hay mắt để so sánh cường độ sáng của các đốm mẫu và đốm chuẩn, từ đó suy ra nồng độ Sắc kí lỏng cao áp aflatoxin trong mẫu. Vì AFT có độ phân cực thấp nên thích hợp cho HPLC pha đảo. Cột sắc kí pha tĩnh có độ phân cực thấp sẽ có ái lực lớn với AFT, sẽ giữ hết AFT trên - tự động hóa nhiều - thiết bị đắt tiền. thao tác. - tốn thời gian - khả năng phân giải - dung môi, hợp chất và phát hiện cao, chlor gây ô nhiễm môi 16 2.2.3 Phương pháp miễn dịch học Phương pháp này dựa trên nguyên lí kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Vì aflatoxin là một phân tử nhỏ (hapten) nên nhiều phương pháp miễn dịch học thông thường (chẳng hạn “ELISA kẹp” (sandwich ELISA)) tỏ ra không hiệu quả. Để phát hiện aflatoxin, một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay là phương pháp ELISA cạnh tranh (competitive ELISA), hoạt động theo quy tắc: AFT cần xác định cạnh tranh với một lượng cố định (AFT – enzyme) để liên kết đặc hiệu vào kháng thể đã được gắn trên pha rắn (polystyrene). Sau đó, các AFT - enzyme bị giữ lại được xác định bằng cách thêm vào một cơ chất có tính đổi màu khi phản ứng với enzyme. Cường độ màu tạo ra được đo bằng quang phổ kế, máy đọc (Elisa reader) hoặc bằng mắt. Nồng độ AFT - enzyme càng thấp thì nồng độ AFT trong mẫu càng cao. Thông thường, người ta tạo một đường chuẩn (standard curve) và kết quả tính toán dựa trên kết quả đo lường cường độ màu của mẫu. Phương pháp này nhằm sàng lọc cùng một lúc nhiều mẫu. Ưu điểm của phương pháp là thực hiện dễ dàng; việc phân tích nhiều mẫu cùng lúc sẽ làm giảm chi phí cho xét nghiệm. Tuy nhiên, độ nhạy và khả năng lặp lại của phương pháp còn kém. Do đó, một phương pháp khác ra đời: phương pháp dùng sắc kí ái lực miễn dịch (Immunoaffinity Chromatography) để đồng thời cô đặc và tinh chế aflatoxin của mẫu cần thử nghiệm. 2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch Qui trình phân tích aflatoxin của các phương pháp đề cập trên phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch và cô đặc. Việc định tính và định lượng aflatoxin dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Hơn nữa, với nhu cầu ngày càng lớn của công nghệ thực phẩm, yêu cầu về chất lượng cuộc sống ngày càng tăng, qui định về tiêu chuẩn an toàn thực phẩm ngày càng trở nên nghiêm ngặt; đặc biệt, trong giao dịch quốc tế, với nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích, thì một kĩ thuật sắc kí mới ra đời, đó là sắc kí ái lực miễn dịch (IAC), sử dụng kháng thể đặc hiệu với aflatoxin(s) mang nhiều ưu điểm mà các phương pháp hóa lí không có được: • Mang tính chọn lọc, có khả năng loại trừ các tạp chất để đạt kết quả xét nghiệm đáng tin cậy. Ưu điểm này được xem là tiến bộ nhất.